PrecisionAb 抗体 — バリデーションを強化した抗体

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抗体は生物医学研究において最も重要な研究ツールの一つである．近年，複数の研究が公表データの信頼性に疑問を呈し，低品質な抗体が結果の一貫性を損なう要因となっていることが指摘されている（Bordeaux et al. 2010, Prinz et al. 2011, Baker and Dolgin 2017）．

抗体バリデーションとは？

「抗体バリデーションとは，特定の抗体が意図された用途や目的に適していることを，実験的に証明し文書化することである」（Weller 2018）． これに対応するため，International Working Group on Antibody Validation（IWGAV）は，抗体バリデーションに関する包括的なガイドラインを提案している（Uhlen et al. 2016）． IWGAV は，バリデーション試験の枠組みとなる 5つのバリデーションの柱（Five Pillars of Antibody Validation） を定義した．これには 遺伝学的手法，直交的手法，独立抗体による手法，タグ付きタンパク質の発現，および免疫沈降（IP）後の質量分析（MS） が含まれる．

Bio‑Rad の PrecisionAb 抗体ラインアップ

Bio‑Rad は，お客様に信頼性の高い研究ツールを提供することに努めており，抗体の品質基準を絶えず引き上げています． PrecisionAb 抗体ラインアップは，ウエスタンブロッティングにおける特異性と再現性について厳格に検証されており，研究者が最高クラスの品質でウエスタンブロットデータを得られるよう設計されています． さらに現在，PrecisionAb 抗体の検証対象アプリケーションを拡大し，免疫蛍光法（IF）および免疫沈降法（IP）にも対応しています（Figure1）．

PrecisionAb 抗体は，内在性標的を発現する複数の生物学的に関連性のある細胞ライセートおよび組織を用いて評価されています（Figure1）． 必要に応じて，ネガティブコントロールのほか，ヒト血清やヒト／げっ歯類の組織ライセートなど，重要なサンプルも評価に含めています． 各抗体については，標的を発現していると予想されるライセートを特定するため文献を慎重に調査し，その情報を評価に活用しています． ウェスタンブロットは科学者が実施し，関連するバイオインフォマティクスデータベースの情報と特異シグナルと背景ノイズの相対強度を比較しながらデータを精査し，最良の抗体のみが PrecisionAb 抗体として選定されています．

Figure1. A： PCNA 抗体 (VMA00018) 矢印は PCNA（分子量 29 kDa）を示す．B： HeLa 細胞を 5 µg/ml のマウス抗 GPI 抗体（VMA00348，緑）で染色．核染色には Hoechst （青）を用い，20×対物レンズで撮影．

Bio‑Rad の stain-free イメージング技術を使用して，タンパク質のローディング量の一貫性と転写効率をモニターしています．

透明性の高いバリデーション手法

私たちは，製造および試験プロセスにおける透明性が，お客様の研究ニーズに適した試薬を選択していただくうえで重要であると考えています．このため，すべての抗体には，その作製に使用した免疫原の詳細や，ウエスタンブロッティングなどの推奨アプリケーションにおける推奨条件など，詳細な情報を提供しています．当社のウエスタンブロット画像は，分子量範囲を狭めるためにトリミングすることはありません．そのため，追加バンドやオフターゲットのシグナルが除外されることはありません．また，各抗体のレビューや，その抗体が使用された論文情報についても提供しています．

ノックアウトおよびノックダウンバリデーション

Bio‑Rad は，当社の抗体を用いて研究者が信頼性が高く再現性のあるウエスタンブロッティング実験を行えるよう，必要な取り組みを進めています．

また，IWGAV の推奨事項に準拠するため，5 本柱の検証アプローチで推奨されている検証方法の導入も進めています． これには，CRISPR/Cas9 を用いて遺伝子ノックアウトを実施し，ノックアウト細胞と野生型細胞の標的タンパク質レベルを比較する手法が含まれます（Figure2）．

Fig2. CRISPR によるビメンチンノックアウト HeLa 細胞（Vimentin KO）および野生型 HeLa 細胞（WT）の全細胞ライセートのウエスタンブロット解析．
A： ヒト抗ビメンチン抗体  (VMA00008) で検出．B： hFAB Rhodamine 標識抗チューブリン一次抗体 (12004166). で検出．
C： CRISPR ノックアウト株と野生型株のライセートにおけるビメンチンの正規化シグナル強度．シグナル強度は総タンパク質量で正規化した．

私たちは，siRNA によるノックダウンも実施しています．
Figure3は，特定の CCAR2 抗体（VMA00564）を用いたウエスタンブロットにおいて，siRNA 処理細胞（Figure3A レーン1および2）と未処理細胞（Figure3A レーン−）の違いを示しています．
また，siRNA を用いた手法で検証された各抗体について，シグナル強度を定量しています（Figure3B）．
siRNA 処理サンプルでは，抗体反応シグナルが対照サンプルと比べて低下しており，これにより抗体の特異性が確認されます．
なお，各抗体についてオンラインで提供されるデータシートおよび検証データは，ロットごとに固有です．

Fig3. A： CCAR2 を標的とする 2 種類の siRNA 二本鎖（1 および 2），またはスクランブル siRNA（−）を個別にトランスフェクトした HEK293 細胞から調製した全細胞ライセートのウエスタンブロット解析．検出には，マウス抗 CCAR2 抗体（VMA00564）および hFAB Rhodamine 標識抗チューブリン一次抗体 (12004166). を使用した．
イメージングは ChemiDoc MP システムで行い，化学発光チャネルは 60 秒，Rhodamine チャネルは 10 秒で露光した．B： チューブリンシグナルに対して正規化した CCAR2 シグナル強度．

IP-MS バリデーション

抗体標的の検証のため，免疫沈降（IP）と質量分析（MS）を組み合わせた手法（IP‑MS）も実施している． まず，選択した抗体に対する免疫沈降条件を最適化する．次に，IP の溶出画分（エルエート）を MS 解析し，サンプル中のタンパク質由来のペプチド配列を同定する． 標的特異性を検証するため，バックグラウンドを除いたうえで，検出されたユニークペプチド数とそのタンパク質量（特定タンパク質由来ペプチドの総量）を評価する． ユニークペプチド数が多く，タンパク質量も高いタンパク質を有意なタンパク質として同定する． この検証手法は，抗体が細胞ライセート中で内在性レベルで発現する対応抗原を確実に認識できることを示している．

Figure4. K562 細胞全細胞ライセートからの POLR2A の免疫沈降．Input レーンは 10% インプット．POLR2A‑IP レーンは POLR2A 抗体（VMA00613）による免疫沈降，IgG‑IP レーンはマウスモノクローナル IgG (MCA929). ウエスタンブロット解析は POLR2A 抗体（VMA00613）を用いて行い，HRP 標識ヤギ抗マウス IgG (1705047) で検出した．その後，ChemiDoc MP イメージングシステムで可視化した．矢印は POLR2A を示す．

リン酸化特異的抗体のバリデーション

リン酸化特異的抗体については，キナーゼ活性化処理やホスファターゼ阻害処理を行った細胞ライセートと未処理ライセートにおける抗体結合を比較し，さらにウエスタンブロット膜上でタンパク質を脱リン酸化することで検証を行っている． リン酸化特異的抗体と総タンパク質抗体の結合特性の違いを示すため，リン酸化特異的 PrecisionAb 抗体を総タンパク質 PrecisionAb 抗体と比較している． これにより研究者は，各種処理がシグナルに与える影響を評価でき，適切なコントロールの選択にも役立つ（Figure5）．

Figure5. 未処理および EGF 処理した HepG2 細胞の全細胞ライセートのウエスタンブロット解析．A： マウス抗 STAT3 抗体 (VMA00242) B： マウス抗STAT3（pSer727）抗体（VMA00755）でプローし，HRP 標識ヤギ抗マウス IgG（1/10,000，STAR207P）で検出した．膜はラムダプロテインホスファターゼ処理（＋）または未処理（−）とし，ChemiDoc MP イメージングシステムでA：52 秒，B：300 秒 の露光で可視化した．
STAT3（pSer727）の分子量は 84 kDa である．

適切な抗体を選ぶ

抗体選択で少し迷ったり，判断に自信が持てないことはありませんか？

実験に適した抗体の選び方 ガイドでは，抗体を選定する際に押さえておくべき重要なポイントをわかりやすく解説しています． また，専門的なサポートが必要な場合には，Bio‑Rad が誇る充実したテクニカルサポートをご利用いただけます． 私たちは，皆様の実験成功を支援するための製品とサポートの提供に今後も尽力してまいります．

※製品は研究用であり，診断目的には御利用いただけません

参考文献

• Baker M and Dolgin E (2017). Cancer reproducibility project releases first results. Nature  541(7637), 269-270.
• Bordeaux J et al. (2010). Antibody validation. Biotechniques 48(3), 197-209.
• Prinz F et al. (2011). Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets? Nat Rev Drug Discov 10(9), 712.
• Uhlen M et al. (2016). A proposal for validation of antibodies. Nature Methods 13, 823-827.
• Weller MG (2018). Ten basic rules of antibody validation. Anal Chem Insights 13:1177390118757462.