抗バイオ医薬品抗体の品質管理(QC)と特性評価

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概要

再現性と正確性は，バイオアナリティカルアッセイの開発において不可欠です．当社は，これらのアッセイに使用される抗体が，高い特異性，高品質で製造され，一貫した基準で供給される必要があることを理解しています．これにより，アッセイの変動を最小限に抑え，結果に自信を持っていただけます．

当社は，HuCAL®リコンビナントモノクローナル抗体ライブラリと，改良された独自の抗体ファージディスプレイ法を用いて，バイオアナリティカルアッセイ用の完全ヒト化抗バイオ治療抗体（Fabおよび全長免疫グロブリン（Ig）フォーマット）を作製しています．このプロセスの中核をなすのは，in vitroガイド選択法であり，これにより，特異性の高い阻害型および非阻害型イディオタイプ抗体や，特殊な薬物-標的複合体結合体の作製が可能にります．抗体配列は常に特定され，長期的なセキュリティのために保管されており，当社の方法は確立され，実証済みで，高い再現性を有しています．

新しい抗体とそれ以降のバッチ（ロット）は，厳格な品質管理（QC）手順の対象となり，毎回高品質な製品をお届けするために実施されています．これにより，重要な試薬のライフサイクル管理，特性評価，供給を適切に管理し，時間経過に伴う最適なアッセイ性能を維持することが可能です．

以下の例は，Bio-Radで品質管理手順および抗バイオ治療抗体の製品開発の一環として抗体バッチ（ロット）の特性評価に適用する分析手法についての情報を示しています．

品質管理（Quality Control)

バッチ間の一貫性

Ig全長フォーマットの試薬については，抗体バッチを抗薬物抗体（ADA）ブリッジングELISA法を用いて試験し，比較します．Figure 1は，このような試験の例として，抗palivizumab抗体を使用したバッチ間の一貫性を示しています．

Fig. 1. バッチ間の一貫性． マイクロタイタープレートに，1 µg/mlの濃度でpalivizumabを一晩コーティングした．洗浄後5%BSA入りのPBST溶液でブロッキングし，各濃度のヒト抗palivizumab抗体 (HCA262, ロット1-4) を含む10%ヒト血清を添加した．検出は，HISPECアッセイ希釈液 (BUF049A) 中に2 µg/mlの濃度で調製したHRP標識palivizumabと，QuantaBlu™蛍光ペルオキシダーゼ基質を用いて行いました．PalivizumabのHRP標識は， LYNX Rapid HRP Antibody Conjugation Kit®. を使用して実施しました．データは，各データポイントの3回の測定値の平均値として示されています．EC50値（右の表）は，非線形曲線フィッティングから算出されました．

バッチリリースにおける品質管理

新しい製品は，まず3つの独立したバッチで製造されます．各バッチの活性は，リガンド結合アッセイで比較されます：Fab抗体用のELISA滴定（Figure 6），Ig抗体用のADAブリッジングELISA（Figure 1およびFigure 7）．平均曲線に最も近いバッチが，今後の基準バッチとして選択されます．新しいバッチは，同じアッセイプロトコルを使用して基準バッチと比較されます．

出荷前には，すべての抗体の新しいバッチについて，特異性（Figure 2およびFigure 3）と純度を定期的に検査します．また，Ig抗体の全長については，SEC（Figure 4）により単分散性を確認します．さらに，各新しいバッチの製造ごとに，抗体遺伝子を再シーケンシングし，製品の同一性を確認します．

SDS-PAGE

Fabフォーマット抗体の純度は，SDS-PAGE法とその後Coomassie染色で評価される（Figure 2）．

Fig. 2. Fabフォーマット抗体の純度評価．ヒト抗trastuzumab (HCA167), 抗bevacizumab (HCA182), および抗infliximab (HCA212) Fab抗体をSDS-PAGE（1レーンあたり2 µg）で分析した．重鎖（H）と軽鎖（L）はそれぞれ約32 kDaと約28 kDaで検出された．

キャピラリー電気泳動（CE）

全長免疫グロブリンフォーマットの抗体純度は，キャピラリー電気泳動（CE）を用いて評価されます．出力はfigure 3のようなvirtualゲルで示される．

Figure 3. Igフォーマット抗体の純度評価．ヒト抗palivizumab hIgG（HCA262，ロット1~3）の3つの異なるバッチをCEで分析した．サンプルは変性処理後，還元条件と非還元条件下で分析された．還元変性条件下で，重鎖（H）と軽鎖（L）はそれぞれ約50 kDaと約30 kDaで検出された．非還元変性条件下では，完全なIgG分子（H2L2）が約150 kDaで検出された．

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）

SECは，凝集体の存在または不在を検出するために使用されます（Figure 4）．

4. SEC分析。 3つの異なるバッチのヒト抗パリビズマブhIgG（HCA262、ロット1～3）をSECで分析した。

一般的な抗体の特性評価

長期安定性

抗体の保存安定性は，加速安定性試験プロトコルを使用するか，数回の凍結融解サイクル後の活性をモニタリングすることで評価できます．以下の例では，抗bevacizumab抗体HCA185（ヒトIgG1）を，37°Cで最大14日間培養後の活性を測定することで評価しました．

Fig. 5. 加速安定性試験．解凍したてのヒト抗bevacizumab hIgG (HCA185)を1 mg/mlに希釈し，分注して37℃で静置した．各時間点で37°Cから分注液を取り出し，コントロールと共に4°Cに置いた．アッセイには，bevacizumabを1 µg/mlの濃度で一晩マイクロタイタープレートにコーティングした．洗浄後5%BSA入りのPBST溶液でブロッキングし，各濃度のヒト抗bevacizumab hlgG（ HCA185 ）を含む10%ヒト血清を添加した．検出は，HISPECアッセイ希釈液 (BUF049A) 中に2 µg/mlの濃度で溶解したHRP標識bevacizumabと，QuantaBlu蛍光ペルオキシダーゼ基質を用いて行った．BevacizumabのHRP標識は，LYNX Rapid HRP Antibody Conjugation Kitを使用した．データは3回の測定の平均値として示される．EC50値（右の表）は非線形曲線フィットから算出された．

以下の例では，抗adalimumab抗体HCA202（Fabフォーマット）の2つの独立したバッチを，間接ELISAを用いて数回の凍結融解サイクル後に活性を試験した（Figure 6）

Fig. 6. Fabフォーマットの凍結融解試験．ヒト抗adalimumab Fab-FH 抗体 (HCA202) ロット1（左）とロット2（右）を，指定された回数の凍結融解サイクル数（FT）に供した．試験には，adalimumabを5 µg/mlの濃度で一晩コーティングしたマイクロタイタープレートを使用した．洗浄後5%BSA入りのPBST溶液でブロッキングし，各濃度のヒト抗adalimumabFab-FH抗体を含む10%ヒト血清を添加した．検出には，HISPECアッセイ希釈液（BUF049A）で1:2000希釈したHRP標識抗ヒスチジンタグ抗体 (MCA5995P) とQuantaBlu蛍光ペルオキシダーゼ基質を使用した．データは3回の測定の平均値として示される．EC50値（グラフ下の表）は，非線形曲線フィッティングから算出された．

同様に，抗adalimuma抗体HCA204（ヒトIgG1）の2つの独立したバッチについても，凍結融解サイクル後の活性試験を実施しました．今回はADAブリッジングELISA法を用いて試験を行い，その結果はfigure 7に示されています．

Fig. 7. Igフォーマットの凍結融解試験. ヒト抗adalimuma hIgG1 (HCA204) ロット1（左）とロット2（右）を，指定された回数の凍結融解サイクル（FT）に供した．試験には，adalimumaを1 µg/mlの濃度で一晩マイクロタイタープレートにコーティングした．洗浄後5%BSA入りのPBST溶液でブロッキングし，各濃度のヒト抗adalimumahIgGを添加した．検出には，HISPECアッセイ希釈液（BUF049A）中に2 µg/mlの濃度で溶解したHRP標識adalimumaと，QuantaBlu蛍光ペルオキシダーゼ基質を使用した．AdalimumaのHRP標識は，LYNX Rapid HRP Antibody Conjugation Kitを使用して行った．データは3回の測定の平均値として示される．EC50値（グラフ下の表）は，非線形曲線フィットから算出された．

抗体親和性測定

親和性は，抗原と抗体の結合部位間の結合の強さを指します．抗体とその抗原間の平衡解離定数はKDと表記され，実験的に測定された解離速度定数（ka）と結合速度定数（kd）の比です．KD値が低いほど，抗体の親和性は高くなります．当社は，すべての一価の抗バイオ治療用抗体の親和性を，バイオレイヤー干渉法用いて測定しています．以下のFigure 8は阻害性抗イディオタイプ抗体，Figure 9は特異的な薬物-標的複合体特異的抗体の例を示しています．親和性測定にはモノバレントFab形式を使用します．測定された親和性は，抗原との一価の相互作用による本来の抗原結合親和性を正しく反映するため，親和性決定には一価のFabフォーマットを使用している．抗体の親和性を知ることで，アッセイ開発者は達成可能なアッセイの感度を知ることができる．

※記載の製品は研究用であり，診断目的にはご利用いただけません．

Fig. 8. 阻害型（タイプ1）抗イディオタイプ抗体の親和性測定．10 µg/mlのpanitumumabを10 mMナトリウムアセテート（pH 4）に溶解し，コーティング密度1.4 ± 0.1 nmでOctet® RED384（Pall FortéBio）AR2Gセンサーに固定化した．ヒト抗panitumumab抗体 (HCA265), の一価のFabフォーマットを，初期濃度6.25 nMから1:2の希釈系列でセンサー表面に流した．基準として，実験用バッファーのみを流した追加のセンサーを使用し，ベースラインのドリフトを補正した．各サイクル後，センサーは10 mMグリシンpH 2.0で再生した．実験用バッファーは，PBS pH 7.4，0.1%（w/v）BSA，0.02%（v/v）Tween-20®を使用した．実験は30°C，攪拌速度1000 rpmで実施した．データはFortéBio Data Analysisソフトウェア8.2.0.7を使用して1:1相互作用モデルでフィッティングした．測定データは青色で示し，相互作用のフィットは赤色で示した．算出した結合速度，解離速度，およびKD値は表に示す．

Fig. 9. 薬物-標的複合体特異的（タイプ3）抗体の親和性測定．10 µg/mlのomalizumab（ヒトIgE抗体）を10 mMナトリウムアセテート緩衝液（pH 6）に溶解し，コーティング密度2.8 ± 0.1 nmでOctet RED384（Pall FortéBio）AR2Gセンサーに固定化した．ヒトIgE（hIgE）との複合体は，実験緩衝液中に10 µg/mlのhIgEを加えることで形成した．hIgEの追加信号は1.3 ± 0.1 nmであった．hIgE/omalizumab複合体特異的抗体（HCA238）の一価のFabフォーマットを，開始濃度48 nMから1:2の希釈系列でセンサー表面に流した．固定化されたomalizumab/hIgE複合体を有する追加のセンサーを，実験バッファーのみで流して，ベースラインのドリフトを補正するための参照として使用した．実験緩衝液は，pH 7.4，0.1%（w/v）BSA，0.02%（v/v）Tween-20を含むPBSを使用した．実験は30°Cで，攪拌速度1000 rpmで行われた．データはFortéBio Data Analysisソフトウェア8.2.0.7を使用して，1:1相互作用モデルでフィッティングした．測定データは青色で示し，相互作用のフィットは赤色で示した．計算された結合速度，解離速度，およびKD値は表に示す．

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